Diferencia entre un microscopio de fluorescencia y un microscopio normal
Recientemente intenté hacer algunas secciones congeladas de ratones. A continuación, usaré un microscopio de fluorescencia para ver si el virus que inyecté está en el área del cerebro que quiero. Es necesario aprender brevemente algunos principios básicos de la microscopía de fluorescencia y los compartiré aquí.
Los microscopios de fluorescencia utilizan luz ultravioleta como fuente de luz para iluminar el objeto que se está inspeccionando, lo que hace que el objeto emita luz y luego lo observe bajo el microscopio. Se utiliza principalmente para células de inmunofluorescencia. Se compone principalmente de una fuente de luz, un sistema de placa de filtro y un sistema óptico. La imagen fluorescente de la muestra se observa a través del aumento del ocular y la lente del objetivo. Echemos un vistazo a la diferencia entre un microscopio de fluorescencia y un microscopio óptico común.
1. Mira el método de iluminación.
El método de iluminación del microscopio de fluorescencia es generalmente epiiluminación, lo que significa que la fuente de luz se coloca sobre la muestra de prueba a través de la lente del objetivo.
2. Mira la resolución
Los microscopios de fluorescencia utilizan luz ultravioleta como fuente de luz, que tiene una longitud de onda más corta pero una resolución más alta que los microscopios ópticos comunes.
3. Diferencias en filtros
Los microscopios de fluorescencia utilizan dos filtros especiales, uno que se usa frente a la fuente de luz para filtrar la luz visible y otro que se usa entre la lente del objetivo y el ocular para filtrar los rayos ultravioleta, que pueden proteger los ojos humanos.
El microscopio de fluorescencia también es un tipo de microscopio óptico. La razón principal es que la longitud de onda excitada por el microscopio de fluorescencia es corta, por lo que esto lleva a la diferencia en estructura y uso entre el microscopio de fluorescencia y el microscopio ordinario. La mayoría de los microscopios de fluorescencia tienen una buena función para capturar la luz débil. , por lo que su capacidad de obtención de imágenes también es buena en condiciones de fluorescencia extremadamente débil. Junto con la mejora continua de los microscopios de fluorescencia en los últimos años, el ruido también se ha reducido considerablemente. Por ello, cada vez se utilizan más microscopios de fluorescencia.
Conocimientos sobre microscopía de fluorescencia de dos fotones.
El principio básico de la excitación de dos fotones es: bajo la condición de alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber dos fotones de longitud de onda larga al mismo tiempo y, después de una corta vida útil del llamado estado excitado, emitir un fotón con una longitud de onda más corta. . El efecto es el mismo que utilizar un fotón con una longitud de onda la mitad de la longitud de onda larga para excitar moléculas fluorescentes. La excitación de dos fotones requiere una alta densidad de fotones. Para no dañar las células, los microscopios de dos fotones utilizan láseres de pulso de modo bloqueado de alta energía. Este láser emite luz láser con un pico de energía alto y una energía promedio baja, con un ancho de pulso de solo 100 femtosegundos y una frecuencia de 80 a 100 MHz. Cuando se utiliza una lente objetivo de alta apertura numérica para enfocar los fotones del láser pulsado, la densidad de fotones en el enfoque de la lente objetivo es la más alta. La excitación de dos fotones sólo se produce en el foco de la lente del objetivo, por lo que el microscopio de dos fotones no requiere un orificio confocal, lo que mejora la eficiencia de la detección de fluorescencia.
En el fenómeno de fluorescencia general, debido a la baja densidad de fotones de la luz de excitación, una molécula fluorescente sólo puede absorber un fotón al mismo tiempo y luego emitir un fotón de fluorescencia a través de una transición radiativa. Esta es la fluorescencia de fotón único. Para el proceso de excitación de fluorescencia que utiliza láser como fuente de luz, pueden ocurrir fenómenos de fluorescencia de dos fotones o incluso de múltiples fotones. En este caso, la intensidad de la fuente de luz de excitación utilizada es alta y la densidad de fotones cumple con el requisito de que las moléculas fluorescentes absorban dos fotones al mismo tiempo. En el proceso de utilizar láseres ordinarios como fuentes de luz de excitación, la densidad de fotones aún no es suficiente para producir una absorción de dos fotones. Generalmente se utilizan láseres de pulso de femtosegundo y su potencia instantánea puede alcanzar el nivel de megavatios. Por lo tanto, la longitud de onda de la fluorescencia de dos fotones es más corta que la longitud de onda de la luz de excitación, lo que equivale al efecto producido por la excitación de longitud de onda de media excitación.
