Determinación del número de microorganismos: ¡el método de conteo directo del microscopio!
El crecimiento de la población bacteriana se manifiesta por un aumento en el número de células o un aumento en la masa celular. Los métodos para determinar el número de células incluyen el método de recuento de microscopio directo, el método de recuento de colonias en placa, el método de proporción de aceite fotoeléctrico, el método de máxima probabilidad y el método de filtración por membrana. Los métodos para medir la materia celular incluyen la determinación del peso seco celular, la determinación de ciertos componentes celulares como el contenido de nitrógeno, ARN y ADN, y la determinación de metabolitos. En resumen, existen muchos métodos para medir el crecimiento de microorganismos, cada uno con sus propias ventajas y desventajas, y deben seleccionarse de acuerdo con la situación específica. Este experimento presenta principalmente el método de conteo directo del microscopio comúnmente utilizado en la producción y la investigación científica.
1. Requisitos del propósito
1. Aclarar el principio del conteo de células sanguíneas.
2. Dominar el método de conteo de microorganismos utilizando un contador de células sanguíneas.
2. Principios básicos
El método de conteo directo con microscopio es un método simple, rápido e intuitivo para contar directamente una pequeña cantidad de suspensión de la muestra que se analizará en un portaobjetos de vidrio especial con un área y un volumen determinados (también conocido como contador de bacterias). Métodos. En la actualidad, los contadores de bacterias comúnmente utilizados en el país y en el extranjero son: tablero de recuento de células sanguíneas, contador de bacterias Peteroff-Hauser y contador de bacterias Hawksley, etc. Se pueden utilizar para el recuento de levaduras, bacterias, esporas de moho y otras suspensiones, y el principio básico es el mismo. Los dos últimos tipos de contadores de bacterias tienen un volumen total de 0.02 mm3 después de cubrirse con un cubreobjetos, y la distancia entre el cubreobjetos y el portaobjetos es de solo 0,02 mm, por lo que el aceite La lente del objetivo de inmersión se puede usar para observar y observar células pequeñas como las bacterias. contar. Además de estos bacteriómetros, también existe un método de estimación de la relación entre el área del frotis y el área del campo visual observado directamente bajo el microscopio, que generalmente se usa para el examen bacteriológico de la leche. Las ventajas del método de conteo directo del microscopio son intuitivas, rápidas y fáciles de operar. Sin embargo, la desventaja de este método es que el resultado medido suele ser la suma de células vivas y muertas. En la actualidad, existen algunos métodos para superar esta deficiencia, como la combinación de cultivos de microcámara de tinción de bacterias viables (tiempo corto) y la adición de inhibidores de la división celular para lograr el propósito de contar solo bacterias viables.
En este experimento, se utilizó un hemocitómetro como ejemplo para el recuento microscópico directo. Para el uso de los otros dos tipos de contadores de bacterias, consulte las instrucciones de cada fabricante. Contar directamente bajo el microscopio con un hemocitómetro es un método comúnmente utilizado para contar microorganismos. La placa de conteo es un portaobjetos de vidrio especial, en el que tres plataformas están formadas por cuatro ranuras; la plataforma más ancha en el medio está dividida en dos mitades por una pequeña ranura transversal, y hay una rejilla a cada lado de la plataforma. Cada cuadrícula está dividida en nueve cuadrados grandes, y el cuadrado grande en el medio es la sala de conteo. La estructura de la placa de recuento de glóbulos se muestra en la Figura l{{{{10}}}}. La escala de la sala de conteo generalmente tiene dos especificaciones, una es un cuadrado grande dividido en 25 cuadrados medios, y cada cuadrado medio está dividido en 16 cuadrados pequeños (Figura 15-2); el otro es un gran cuadrado. El cuadrado está dividido en 16 cuadrados medios, y cada cuadrado medio está dividido en 25 cuadrados pequeños, pero no importa qué tipo de tablero sea, hay 400 cuadrados pequeños en cada cuadrado grande. La longitud del lado de cada cuadrado grande es de 1 mm y el área de cada cuadrado grande es de 1 mm2. Después de cubrir con un cubreobjetos, la altura entre el cubreobjetos y el portaobjetos es de 0,1 mm, por lo que el volumen de la cámara de recuento es de 0,1 mm3 (una milésima de mililitro). Figura 15-1 La estructura del tablero de conteo de glóbulos (1) Figura 15-2 La estructura del tablero de conteo de glóbulos (2) A. Vista frontal; B. Vista de sección longitudinal; La cuadrícula ampliada, el cuadrado grande en el medio es la cámara de conteo 1. Placa de conteo de células sanguíneas; 2. Cubierta de vidrio; 3. Cuando cuente en la cámara de conteo, generalmente cuente el número total de bacterias en cinco cuadrados, luego calcule el promedio de cada cuadrado y multiplique por 25 o 16 para obtener El número total de bacterias en un cuadrado grande se convierte luego en el número total de bacterias en 1 ml de solución bacteriana. Sea A el número total de bacterias en los cinco cuadrados y B la relación de dilución de la solución bacteriana. Si se trata de una placa de recuento con 25 cuadrados, el número total de bacterias en 1 ml de solución bacteriana {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(piezas) De manera similar, si es una placa de conteo con 16 cuadrados medianos, el número total de bacterias en 1 ml de solución bacteriana=A/ 5×16×104×B=32000A·B (piezas)
3. Equipo
1. bacterias
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumentos u otros utensilios
Hemocitómetro, microscopio, cubreobjetos, gotero capilar estéril.
4. Pasos de operación
1. preparación de suspensión bacteriana
Se preparó Saccharomyces cerevisiae en una suspensión bacteriana de concentración apropiada con solución salina fisiológica estéril.
2. Sala de recuento de microscopios
Antes de agregar muestras, inspeccione microscópicamente la cámara de conteo de la placa de conteo. Si hay suciedad, debe limpiarse y secarse antes de contar.
3. Añadir muestra
Cubra el hemocitómetro limpio y seco con un cubreobjetos y luego use un gotero capilar estéril para dejar caer una pequeña gota de la suspensión de Saccharomyces cerevisiae agitada desde el borde del cubreobjetos y deje que la solución bacteriana se mueva automáticamente a lo largo del espacio por ósmosis capilar. Al ingresar a la sala de conteo, la sala de conteo general se puede llenar con líquido bacteriano. Al tomar muestras, primero agite la solución bacteriana; al agregar muestras, no deben generarse burbujas de aire en la cámara de conteo.
4. Conteo de microscopio
Después de agregar la muestra, quédese quieto durante 5 minutos, luego coloque el hemocitómetro en la platina del microscopio, primero encuentre la ubicación de la cámara de conteo con un microscopio de baja potencia y luego cambie a un microscopio de alta potencia para contar. Ajuste la intensidad de la luz del microscopio adecuadamente. Para los microscopios que usan espejos para la iluminación, preste atención para no desviarse de un lado de la luz, de lo contrario no será fácil ver las líneas cuadradas de la sala de conteo claramente en el campo de visión, o solo se verán líneas verticales u horizontales. ser visto. Si se encuentra que la solución bacteriana está demasiado concentrada o demasiado diluida antes del conteo, es necesario reajustar la dilución antes del conteo. Generalmente, la dilución de la muestra requiere de 5 a 10 bacterias en cada celda pequeña. Cada cámara de conteo selecciona 5 celdas intermedias (4 esquinas opcionales y una celda intermedia en el centro) para contar. Las celdas ubicadas en la línea de cuadrícula generalmente solo se cuentan en las líneas superior y derecha. En el caso de la yema de levadura, cuando el tamaño de la yema alcanza la mitad de la célula madre, se cuenta como dos células bacterianas. Para contar una muestra, calcule el contenido bacteriano de la muestra calculando el valor promedio de las dos cámaras de conteo.
5. Lave el conteo de células sanguíneas.
Después del uso, enjuague la tabla de conteo de células sanguíneas con agua del grifo, no la frote con objetos duros y séquela usted mismo o con un secador de pelo después del lavado. Examen microscópico para observar si hay bacterias residuales u otros sedimentos en cada celda pequeña. Si no está limpio, debe lavarse repetidamente hasta que esté limpio.
