Comparación entre microscopio confocal y microscopio óptico ordinario.
microscopio óptico general
El microscopio biológico general consta de tres partes, a saber: ① sistema de iluminación, que incluye fuente de luz y condensador; ② El sistema de amplificación óptica, que consta de lente objetivo y ocular, es el cuerpo principal del microscopio. Para eliminar la aberración esférica y la aberración cromática, tanto el ocular como el objetivo están compuestos por grupos de lentes complejos; (3) dispositivo mecánico, utilizado para fijar materiales y observar cómodamente.
Que la imagen del microscopio sea clara o no depende no sólo del aumento, sino también de la resolución del microscopio. La resolución se refiere a la capacidad del microscopio (o el lugar donde los ojos humanos están a 25 cm del objetivo) para distinguir el pequeño intervalo del objeto zui. La resolución depende de la longitud de onda de la luz, la relación de apertura y el índice de refracción del medio, que se expresa mediante la fórmula:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Donde: n= índice de refracción del medio;=ángulo del espejo (el ángulo de apertura de la muestra con respecto a la apertura de la lente) y NA= apertura numérica. ¿El ángulo del espejo es siempre inferior a 180? Por lo tanto, el valor zui de sina/2 debe ser menor que 1.
El índice de refracción del vidrio utilizado para fabricar lentes ópticas es de 1,65 a 1,78, y cuanto más cerca del índice de refracción del medio utilizado se acerque el del vidrio, mejor. Para el objetivo seco, el medio es aire y la relación de apertura es generalmente 0.05 ~ 0,95; La lente de aceite utiliza asfalto fragante como medio y la tasa de apertura de la lente puede ser cercana a 1,5.
La longitud de onda de la luz ordinaria es de 400~700 nm, por lo que la resolución del microscopio no es inferior a 0,2 μm y la resolución del ojo humano es de 0,2 mm, por lo que el gran aumento del zui diseñado por El microscopio general suele ser de 1000X x.
¿Por qué necesitas un microscopio confocal?
1. El microscopio óptico se ha perfeccionado gracias al esfuerzo y la mejora de nuestros grandes predecesores. De hecho, los microscopios comunes pueden proporcionarnos hermosas imágenes microscópicas de manera simple y rápida. Sin embargo, ocurrió un evento que trajo una innovación revolucionaria a este mundo de microscopios casi perfecto: la invención del "microscopio confocal de barrido láser". Este nuevo microscopio se caracteriza por adoptar un sistema óptico que únicamente extrae la información de la imagen en el plano donde se concentra el enfoque, y restaura la información obtenida en la memoria de la imagen mientras cambia el enfoque, de modo que se obtiene una imagen vívida con información tridimensional completa. Puede ser obtenido. Mediante este método, se puede obtener fácilmente información sobre la forma de la superficie que no puede confirmarse con microscopios comunes. Además, para los microscopios ópticos ordinarios, "mejorar la resolución" y "profundizar la profundidad de enfoque" son condiciones contradictorias, especialmente con un gran aumento, pero para los microscopios confocales este problema está resuelto.
2. Ventajas del sistema óptico confocal
El sistema óptico confocal ilumina el punto de muestra y la luz reflejada también es recibida por receptores puntuales. Cuando la muestra se coloca en la posición de enfoque, casi toda la luz reflejada puede llegar al fotorreceptor, pero cuando la muestra se desvía del foco, la luz reflejada no puede llegar al fotorreceptor. Es decir, en el sistema óptico confocal solo se emitirá la imagen que coincida con el foco, y se protegerán la fácula y la luz dispersada inútil.
3. ¿Por qué utilizar un láser?
En el sistema óptico confocal, la muestra se ilumina y la luz reflejada también es recibida por un fotorreceptor puntual. Por lo tanto, se hace necesaria una fuente de luz puntual. El láser pertenece a una fuente de luz muy puntual. En la mayoría de los casos, la fuente de luz del microscopio confocal adopta una fuente de luz láser. Además, las características del láser, como la monocromaticidad, la directividad y la excelente forma del haz, también son razones importantes para su amplio uso.
4. Se hace posible la observación en tiempo real basada en escaneo de alta velocidad.
En el escaneo láser, el deflector óptico acústico (elemento principal AO) se utiliza en dirección horizontal y el espejo servogalvano se utiliza en dirección vertical. Debido a que no hay ninguna pieza de vibración mecánica en la unidad de desviación óptica acústica, puede escanear a alta velocidad y es posible observar en tiempo real en la pantalla de monitoreo. La alta velocidad de esta cámara es un proyecto muy importante que afecta directamente la velocidad de enfoque y recuperación de posición.
5. Relación entre posición de enfoque y brillo
En el sistema óptico confocal, cuando la muestra se coloca correctamente en la posición de enfoque, el brillo es grande, y antes y después, su brillo disminuirá bruscamente (línea continua en la Figura 4). Esta selectividad sensible del plano focal es también el principio de medir la dirección de la altura del microscopio confocal y expandir la profundidad focal. En contraste, el microscopio óptico ordinario no tiene cambios de brillo obvios antes y después de la posición de enfoque (línea de puntos en la Figura 4).
6. Alto contraste y alta resolución
En el microscopio óptico general, la luz reflejada que se desvía del foco interferirá y se superpondrá con la parte de imagen del foco, reduciendo así el contraste de la imagen. Por el contrario, en el sistema óptico confocal, la luz dispersada fuera del foco y la luz dispersada dentro de la lente del objetivo se eliminan casi por completo, por lo que se puede obtener una imagen con un contraste muy alto. Además, debido a que la luz pasa dos veces a través de la lente del objetivo, la imagen puntual se vuelve más nítida primero y también se mejora la resolución del microscopio.
7. Función de localización óptica
En el sistema óptico confocal, la luz reflejada de la parte distinta del punto focal está protegida por microporos. Por lo tanto, al observar una muestra tridimensional, se forma una imagen como la que se forma después de cortar la muestra con el foco (Figura 5). Este efecto se denomina localización óptica y pertenece a una de las especialidades del sistema óptico confocal.
8. Función de memoria en movimiento de enfoque
Los microporos protegen la llamada luz reflejada fuera del foco. Por otro lado, se puede considerar que todos los puntos de la imagen formada por el sistema óptico confocal coinciden con el foco. Por lo tanto, si la muestra tridimensional se mueve a lo largo de la dirección del eje Z (eje óptico), la imagen se acumulará y almacenará en la memoria, y zui eventualmente obtendrá la imagen formada por la coincidencia de toda la muestra y el enfoque. . De esta forma, la función de profundidad de enfoque infinita se denomina función de memoria móvil.
9. Función de medición de la forma de la superficie
En la función de movimiento de enfoque, la forma de la superficie de la muestra se puede medir sin contacto agregando un bucle de registro de altura. Con base en esta función, es posible registrar las coordenadas del eje Z formadas por el gran valor de brillo de zui en cada píxel y, con base en esta información, se puede obtener la información relacionada con la forma de la superficie de la muestra.
10. Función de medición de microtamaño de alta precisión
La unidad receptora de luz adopta un sensor de imágenes CCD unidimensional, por lo que no puede verse afectada por la inclinación de escaneo del dispositivo de escaneo, de modo que se pueden completar mediciones de alta precisión. Además, debido a que se adopta al mismo tiempo la función de memoria de movimiento de enfoque con profundidad de enfoque ajustable, se puede eliminar el error de medición causado por el desplazamiento del enfoque.
11. Análisis de imágenes tridimensionales.
Utilizando la función de medición de la forma de la superficie, se puede crear fácilmente una imagen tridimensional de la superficie de la muestra. No solo eso, sino que también se pueden realizar muchos tipos de análisis, tales como: medición de rugosidad de la superficie, área, volumen, área de superficie, circularidad, radio, longitud de zui, perímetro, centro de gravedad, imagen tomográfica, transformada FFT, línea. Medición de ancho, etc.
El microscopio de barrido confocal láser se puede utilizar no sólo para observar la morfología celular, sino también para el análisis cuantitativo de componentes bioquímicos en las células, estadísticas de densidad óptica y medición de la morfología celular.
