Aplicación de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de fluorescencia
TIRFM (Microscopio de fluorescencia de reflexión interna total), microscopio de fluorescencia de reflexión interna total, cuando la luz entra en un medio con un índice de refracción más bajo desde un medio con un índice de refracción alto, si el ángulo de incidencia es lo suficientemente grande, toda la luz se refleja sin refracción, pero en La interfaz de los dos medios produce ondas evanescentes que pueden excitar la fluorescencia dentro de los 100 nm cerca de la interfaz para realizar la observación de la superficie del objeto. La luz de excitación se puede enviar a través del iluminador de un microscopio de fluorescencia convencional o un iluminador especial, y se puede controlar el ángulo de incidencia del láser. El método de excitación de campo instantáneo se utiliza para evitar que la luz de excitación entre en el detector. La luz de excitación en la interfaz entre el vidrio y el agua produce un interior completo implementado por reflexión. Debido a la atenuación exponencial de la luz de excitación, solo el área de muestra muy cercana a la superficie de reflexión total producirá una reflexión de fluorescencia, lo que reduce en gran medida la interferencia del ruido de la luz de fondo con el objetivo de observación, por lo que esta tecnología se usa ampliamente en la observación dinámica. de sustancias de la superficie celular.
Diagrama esquemático de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM)
①Muestra ②Rango de onda evanescente ③Cubierta de vidrio ④Inmersión en aceite ⑤Objetivo ⑥Haz de emisión (señal) ⑦Haz de excitación
Para lograr la reflexión interna total, se requiere un gran ángulo de incidencia, por ejemplo, el ángulo de incidencia en la interfase vidrio-agua es mayor a 61 grados. Esto se puede lograr con un prisma, llamado TIRFM basado en prisma, o con una lente de objetivo con una apertura numérica alta, que se denomina TIRFM de tipo objetivo. Los microscopios de fluorescencia de reflexión interna total comercializados actualmente son generalmente del tipo de lente objetivo, con alta velocidad y alta precisión.
La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total se usa ampliamente en algunos campos biológicos porque puede realizar la observación de fluorescencia en un rango muy delgado (menos de 100 nm) en la superficie de los objetos. Tales como las siguientes aplicaciones:
Observación de imágenes de la superficie celular: estructura de la superficie de la membrana celular, contacto de la superficie celular, dinámica de la superficie de la membrana/localización de proteínas.
Observación y manipulación de moléculas individuales: miosina, actina y ATP marcado con Cy3-.
Movimiento de la superficie de la membrana celular: como engullimiento de vesículas, exhalación de vesículas y exocrino de vesículas. el
Observación del fenómeno de chispas de calcio en la membrana celular, monitoreo de canales iónicos.
Investigación de motores moleculares: motores de rotación, proteínas del citoesqueleto, polímeros, proteínas G, proteínas anulares, motores de nucleótidos.
Además del campo de la biología, también tiene buenas aplicaciones en el campo de la química para la observación de estructuras químicas moleculares.
