Ventajas y desventajas de la microscopía de barrido láser multifotónica
La microscopía de barrido láser multifotónico es un método experimental basado en la tecnología de microscopía de barrido láser, que proporciona capacidades de seccionamiento óptico más precisas en la observación tridimensional. El método de excitación de fluorescencia multifotónica utiliza luz roja de longitud de onda larga o luz infrarroja cercana para recolectar imágenes de fluorescencia de alta resolución de las muestras, lo que causa un daño mínimo a las muestras vivas, por lo que es adecuado para la obtención de imágenes de células vivas, especialmente para tejidos vivos gruesos como cortes de cerebro, embriones, estudios de imágenes de órganos completos o incluso organismos completos.
Las ventajas son las siguientes:
1. Excitado por la luz roja o la luz infrarroja, la dispersión de la luz es pequeña (la dispersión de partículas pequeñas es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda).
2. No hay necesidad de agujeros de alfiler y se pueden recolectar más fotones dispersos de la sección de imágenes.
3. El agujero de alfiler no puede distinguir los fotones dispersos emitidos desde el área desenfocada o el área de enfoque, y la relación señal-ruido de las imágenes multifotónicas en capas profundas es buena.
4. La luz ultravioleta o visible utilizada para la excitación de un solo fotón es fácilmente absorbida y atenuada por la muestra antes de que el haz alcance el plano focal, y no es fácil excitar capas profundas.
5. En términos de observación con microscopio biológico, la primera consideración es no dañar el estado activo del propio organismo y mantener la circulación de agua, concentración de iones, oxígeno y nutrientes. En el caso de la observación de la luz, tanto el calor como la energía de los fotones deben permanecer dentro de la cantidad de irradiación y la energía de la luz que no dañará las células.
6. La microscopía multifotónica también tiene muchas ventajas. Como resolución tridimensional, penetración profunda, eficiencia de dispersión, luz de fondo, relación señal-ruido, control, etc., existen características superiores que los microscopios láser no tienen o tienen incomparables en el pasado.
La microscopía de barrido láser confocal multifotónica se ha extendido a varios campos de investigación y aplicación. Puede realizar una observación tridimensional no destructiva de muestras en estado natural y puede mejorar la resolución y la relación señal-ruido del sistema. Usando materiales de excitación multifotónica, también puede realizar almacenamiento de datos de altura tridimensional y microfabricación de dirección arbitraria tridimensional, que tiene un alto valor de aplicación. Se cree que con el mayor desarrollo de maquinaria, materiales y tecnología láser relacionada con la microscopía confocal multifotónica, habrá más microscopios de barrido láser confocal de fotones que obtendrán un mayor desarrollo y una aplicación más amplia.
Las desventajas son las siguientes:
1. Solo para imágenes de fluorescencia.
2. Si la muestra incluye cromóforos que pueden absorber la luz de excitación, como pigmentos, la muestra puede dañarse térmicamente.
3. La resolución se reduce ligeramente. Aunque se puede mejorar usando la apertura confocal al mismo tiempo, la señal se perderá.
4. Debido a la limitación de los costosos láseres ultrarrápidos, el costo del microscopio de barrido multifotónico es relativamente alto.
