Una comparación de diferentes técnicas para microscopía de superresolución
Para la microscopía de luz convencional, la difracción de la luz limita la resolución de la imagen a aproximadamente 250 nm. Hoy en día, las técnicas de súper resolución pueden mejorar esto en más de un factor de 10. Esta técnica se logra principalmente a través de tres métodos: microscopía de localización de molécula única, que incluye microscopía de localización fotosensible (PALM) y microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM); microscopía de iluminación estructurada (SIM); y microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED). Cómo elegir la tecnología de súper resolución es lo que a todos les importa. "Desafortunadamente, no existen principios simples para decidir qué método usar", dice Mathew Stracy, investigador postdoctoral de la Universidad de Oxford, Reino Unido. "Cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas." Por supuesto, los científicos también están descubriendo cómo elegir el método correcto para un proyecto en particular. "En el contexto de la bioimagen, los factores clave a considerar incluyen: resolución espacial y temporal, sensibilidad al fotodaño, capacidad de etiquetado, grosor de la muestra y fluorescencia de fondo o fluorescencia autóloga de células". Cómo funciona Los diversos microscopios de súper resolución funcionan de diferentes maneras. En el caso de PALM y STORM, solo una pequeña fracción de los marcadores fluorescentes se excitan o fotoactivan en un momento dado, lo que permite su localización independiente con alta precisión. Pasar por este proceso con todas las etiquetas fluorescentes da como resultado una imagen completa de súper resolución. Stefan Hell, uno de los ganadores del Premio Nobel de Química de 2014 y director del Instituto Max Planck de Química Biofísica, dijo: "El sistema PALM/STORM es relativamente fácil de configurar, pero es difícil de aplicar, porque la luz fluorescente El grupo debe tener capacidad de fotoactivación. Limitaciones La desventaja es que necesitan detectar una sola molécula fluorescente en el contexto de una célula, y son menos confiables que STED". STED utiliza un pulso de láser para excitar el fluoróforo y un láser en forma de anillo para extinguir el fluoróforo, dejando solo la fluorescencia de tamaño nanométrico intermedio para la superresolución. Escanear toda la muestra produce una imagen. "La ventaja de STED es que es una tecnología de botón", explicó Hell. "Funciona como un microscopio de fluorescencia confocal estándar". También puede obtener imágenes de células vivas utilizando fluoróforos como proteínas fluorescentes verdes o amarillas y colorantes derivados de la rodamina. Comparación paramétrica Aunque todas las técnicas de superresolución superan a la microscopía óptica convencional en términos de resolución, difieren entre sí. SIM duplica aproximadamente la resolución a alrededor de 100 nm. PALM y STORM pueden resolver objetivos de 15 nm. Según Hell, STED proporciona una resolución espacial de 30 nm en células vivas y de 15 nm en células fijas. Cuando se trata de aplicaciones específicas, también debemos considerar la relación señal-ruido. En algunos casos, una resolución más baja pero una SNR más alta pueden dar como resultado una imagen mejor que lo contrario (resolución más alta pero una SNR más baja). La velocidad de adquisición de imágenes también es muy importante, especialmente para las células vivas. "Todas las técnicas de superresolución son más lentas que las técnicas de imágenes de fluorescencia convencionales", dijo Stracy. "PALM/STORM es el más lento, necesita decenas de miles de cuadros para obtener una sola imagen, SIM necesita docenas de cuadros y STED es una tecnología de escaneo, por lo que la velocidad de adquisición depende del tamaño del campo de visión". Además de las células vivas o las células de imágenes fijas, algunos científicos también quieren comprender cómo se mueven los objetos. Stracy está interesada en comprender la dinámica de los sistemas biológicos en las células vivas, no solo en las imágenes estáticas. Combina PALM con el seguimiento de partículas individuales para analizar la dinámica en las células vivas. De esta manera, puede rastrear directamente las moléculas marcadoras a medida que realizan sus funciones. Sin embargo, cree que SIM no es adecuado para estudiar estos procesos dinámicos a nivel molecular, pero debido a su rápida velocidad de adquisición, es particularmente adecuado para observar la dinámica de estructuras más grandes, como cromosomas completos. Los últimos resultados En 2017, el equipo de Hell informó sobre el microscopio de superresolución MINFLUX en Science. Según Hell, este método de súper resolución logra una resolución espacial de 1 nm por primera vez. Además, puede rastrear moléculas individuales en células vivas al menos 100 veces más rápido que otros métodos. Otros científicos también hablaron muy bien del microscopio MINFLUX. "Constantemente se desarrollan nuevas aplicaciones y enfoques, pero dos avances me llaman la atención", dijo Shechtman. Uno es MINFLUX. "Utiliza un enfoque ingenioso para obtener un posicionamiento molecular muy preciso". Con respecto al segundo desarrollo interesante, Shechtman mencionó a WE Moerner y sus colegas de la Universidad de Stanford. Moerner también recibió el Premio Nobel de Química 2014. Uno de los ganadores. Para abordar la limitación de la resolución de imágenes causada por la dispersión anisotrópica de moléculas individuales fluorescentes, los científicos utilizaron diferentes polarizaciones de excitación para determinar la orientación y la posición de las moléculas. Además, han desarrollado superficies pupilares delicadas. Estas técnicas mejoran la capacidad de localizar estructuras. Acerca de las etiquetas fluorescentes En muchas aplicaciones de súper resolución, las etiquetas realmente importan. También hay algunas empresas que ofrecen productos relacionados. Por ejemplo, Miltenyi de Alemania se asoció con Abberior, una empresa fundada por Stefan Hell, para brindar servicios personalizados de conjugación de anticuerpos para tintes de microscopía de superresolución. Varias otras compañías también ofrecen marcadores coincidentes. "Nuestros Nano-Boosters son muy pequeños, solo 1,5 kDa y muy específicos", dice Christoph Eckert, director de marketing de ChromoTek. Estas proteínas se unen a proteínas fluorescentes verdes y rojas (GFP y RFP). Se derivan de fragmentos de anticuerpos de alpaca, conocidos como VHH o nanocuerpos, con excelentes propiedades de unión y calidad estable sin variación de lote a lote. Estos marcadores son adecuados para diversas técnicas de superresolución, incluidas SIM, PALM, STORM y STED. Ai-Hui Tang, profesor asistente de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, y sus colegas utilizaron GFP-Booster y STORM de ChromoTek para explorar la propagación de información en el sistema nervioso. Encontraron nanoclusters moleculares, llamados nanocolumnas, en neuronas presinápticas y postsinápticas. Los científicos creen que esta estructura muestra que el sistema nervioso central emplea principios simples para mantener y regular la eficiencia sináptica. Varias versiones de imágenes de súper resolución y un número creciente de métodos están llevando a los científicos a profundizar aún más en los misterios biológicos. Al romper el límite de difracción de la luz visible, los biólogos pueden incluso "seguir de cerca" las acciones de las células.
